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如何鑒定長距離運輸的mRNA?

上一期給大家介紹了一篇如何鑒定嫁接中長距離運輸mRNA的方法:嫁接中長距離運輸的mRNA是如何鑒定的?今天給大家介紹已經發表的第2種鑒定長距離運輸的mRNA的方法,兩者方法類似,但也各有不同,...

上一期給大家介紹了一篇如何鑒定嫁接中長距離運輸mRNA的方法:今天給大家介紹已經發表的第2種鑒定長距離運輸的mRNA的方法,兩者方法類似,但也各有不同,該方法引入了SNP用以排除假陽性reads。今天著重介紹下大家都非常關心的實驗設計以及分析思路。

文章簡介

該篇文章是中國農業大學高麗紅教授在International Journal of Molecular Sciences雜志發表題為“Identification of Long-Distance Transmissible mRNA between Scion and Rootstock in Cucurbit Seedling Heterografts”的研究論文,該文章也是通過重測序矯正基因組與轉錄組reads比對方式相結合去除假陽性來鑒定黃瓜-南瓜嫁接體中mRNA 的長距離運輸。

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實驗設計

嫁接組合設置:作者共設四個嫁接組合,如下圖,同源嫁接2個:黃瓜Csa/黃瓜Csa,南瓜Cmo/南瓜Cmo;異源嫁接2個:黃瓜Csa/南瓜Cmo南瓜Cmo/黃瓜Csa。

取樣:1. 分別取南瓜和黃瓜的葉片和根,混合提取DNA,用于重測序建庫測序。2.?每嫁接組合,9株植株作為一個生物學重復,共3個生物學重復,均取接穗的第一子葉(包括葉柄)以及砧木的根混合提取總RNA,分別用于轉錄組測序。

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分析思路

  1. 基因組重建:由于作者所有黃瓜和南瓜材料與參考基因對應材料之間存在差異,所以作者利用重測序數據(120x)替換原參考基因上的SNP、Indel等變異信息,重新構建優化了基因組。

  2. 轉運mRNA識別:如下圖,以南瓜接穗黃瓜砧木為列,識別有接穗南瓜向下運輸至黃瓜砧木的mRNA,分析過程較為復雜,我們分條來說:

(1)首先用黃瓜砧木根的轉錄組數據和重建的黃瓜參考基因進行比對,取未必對上的reads再與重建后的南瓜基因組進行比對,比對上的reads用于后續分析;

(2)取步驟1中比對到南瓜基因上的reads再與來自于黃瓜同源嫁接接穗和根轉錄組合并而來的reads進行blastn比對,不完美匹配的reads(至少存在2個及以上SNP)再次和重建后的南瓜基因組進行比對,比對上的reads用于后續分析;

(3)經過以上多次比對,在步驟2中的再次和南瓜基因組匹配的reads被認為是來自于接穗南瓜向下轉運的mRNA,最后再將這些reads與南瓜CDS序列進行blast比對得到轉運mRNA基因ID。

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兩種方法比較

綜合來看,兩種方法思路類似,但也各有千秋,在基因組重建過程中,第一篇方法中多了物種特異基因組裝過程這一步,而本篇文章在RNA數據比對時引入SNP概念也是一種方法創新。

經常遇到小伙伴問:哪種方法更好呢?我想兩種方法取其優點結合一下才更好,有對此類長距離運輸信使分子鑒定感興趣的小伙伴歡迎添加微信:llcheng1314 咨詢。

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  • 發表于 2022-03-25 20:43
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