如何鑒定長距離運輸的mRNA?
上一期給大家介紹了一篇如何鑒定嫁接中長距離運輸mRNA的方法：今天給大家介紹已經發表的第2種鑒定長距離運輸的mRNA的方法，兩者方法類似，但也各有不同，該方法引入了SNP用以排除假陽性reads。今天著重介紹下大家都非常關心的實驗設計以及分析思路。
文章簡介
該篇文章是中國農業大學高麗紅教授在International Journal of Molecular Sciences雜志發表題為“Identification of Long-Distance Transmissible mRNA between Scion and Rootstock in Cucurbit Seedling Heterografts”的研究論文，該文章也是通過重測序矯正基因組與轉錄組reads比對方式相結合去除假陽性來鑒定黃瓜-南瓜嫁接體中mRNA 的長距離運輸。
實驗設計
嫁接組合設置：作者共設四個嫁接組合，如下圖，同源嫁接2個：黃瓜Csa/黃瓜Csa，南瓜Cmo/南瓜Cmo；異源嫁接2個：黃瓜Csa/南瓜Cmo，南瓜Cmo/黃瓜Csa。
取樣：1. 分別取南瓜和黃瓜的葉片和根，混合提取DNA，用于重測序建庫測序。2.?每嫁接組合，9株植株作為一個生物學重復，共3個生物學重復，均取接穗的第一子葉（包括葉柄）以及砧木的根混合提取總RNA，分別用于轉錄組測序。
分析思路
基因組重建：由于作者所有黃瓜和南瓜材料與參考基因對應材料之間存在差異，所以作者利用重測序數據（120x）替換原參考基因上的SNP、Indel等變異信息，重新構建優化了基因組。
轉運mRNA識別：如下圖，以南瓜接穗黃瓜砧木為列，識別有接穗南瓜向下運輸至黃瓜砧木的mRNA，分析過程較為復雜，我們分條來說：
（1）首先用黃瓜砧木根的轉錄組數據和重建的黃瓜參考基因進行比對，取未必對上的reads再與重建后的南瓜基因組進行比對，比對上的reads用于后續分析；
（2）取步驟1中比對到南瓜基因上的reads再與來自于黃瓜同源嫁接接穗和根轉錄組合并而來的reads進行blastn比對，不完美匹配的reads（至少存在2個及以上SNP）再次和重建后的南瓜基因組進行比對，比對上的reads用于后續分析；
（3）經過以上多次比對，在步驟2中的再次和南瓜基因組匹配的reads被認為是來自于接穗南瓜向下轉運的mRNA，最后再將這些reads與南瓜CDS序列進行blast比對得到轉運mRNA基因ID。
兩種方法比較
綜合來看，兩種方法思路類似，但也各有千秋，在基因組重建過程中，第一篇方法中多了物種特異基因組裝過程這一步，而本篇文章在RNA數據比對時引入SNP概念也是一種方法創新。
經常遇到小伙伴問：哪種方法更好呢？我想兩種方法取其優點結合一下才更好，有對此類長距離運輸信使分子鑒定感興趣的小伙伴歡迎添加微信：llcheng1314 咨詢。
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- 發表于 2022-03-25 20:43
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