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qRT-PCR相對定量計算詳解 qPCR

實時定量PCR也轉錄組結合,計算表達量等等;


做完轉錄組分析之后,一般都要求做qRT-PCR來驗證二代測序得到的轉錄本表達是否可靠。熒光定量PCR是一種相對表達定量的方法,他的計算方法有很多,常用的相對定量數據分析方法有雙標曲線法,ΔCt法,2^-ΔΔCt法(Livak法),用參照基因的ΔCt法和Pfaffl法。這里主要講解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何計算;

qRT-PCR原理:

以基因的cDNA為模板進行PCR擴增,在PCR擴增過程中,通過收集熒光信號,對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期,模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數存在線性關系,所以可以定量。

Ct值是什么意思呢?

Ct 值的含義是:每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數 (cycle)。 qRT-PCR在擴增的時候都會有平臺期,在平臺期之前,PCR 擴增就是簡單的指數增長,也就是 1 變 2,2 變 4,4 變 8 …擴增。數學形式就是 2 的 ct 次方,到了平臺期所有基因擴增的數目是一致的,而唯一有區別的則是 ct 值的不同。所以不難推斷出 ct 值越小,反應擴增到達平臺期所需循環數越少,目的基因起始含量越高。這里可以得到公式:



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計算-ΔΔCt

在這里,我們有一個對照組,一個處理組,還有一個內參基因和目的基因,想看一下目的基因在處理組中相對與對照中的表達差異,也就是計算-ΔΔCt:數據如下:

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1.計算每組內參基因sgAction Ct均值

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  1. 計算第一個 Δct,即每組的待檢目的基因減去內參基因的 Ct 值


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3.計算對照CK組中 Δct 的均值,再用處理組的 每一個Δct 減去剛剛計算的對照CK組的 Δct 均值,得到 ΔΔct(紅框框)


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4.相對表達量計算,也就是相對于對照組: 2^-ΔΔct:

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不難看出這里的-ΔΔct和我們轉錄組當中的log2(fold change)值是一致的,所以如果多做幾個基因就可以繪制類似如下圖:

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或者相關性點圖:

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測試數據表格下載:qRT-PCR_demo_data.xlsx


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  • 發表于 2018-09-20 20:11
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  • 分類:實驗相關

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